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glutathione peroxidase, GSH-Px

点击次数:858 日期:2019/7/17 15:39:11

glutathione peroxidase, GSH-Px

分光光度法50/48

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px

不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应,生成氧化型谷胱甘肽GSSG,从而保护

生物膜免受ROS的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮

抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理:

GSH-Px催化H2O2氧化GSH,产生GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化NADPH还原GSSG

再生GSH,同时NADPH氧化生成NADP+NADPH340nm有特征吸收峰,而NADP+

没有;通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体100mL×1瓶,室温保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4保存。

试剂三:液体20μL×1支,-20保存。

混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一40mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三,

混匀。(注意:必须现配现用,当天使用完)

试剂四:液体5.1mL×1瓶,4保存。

粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,

加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心10min,取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建

500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7

秒,总时间3min);然后8000g4,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.血清等液体:直接测定。

测定操作:

1.分光光度计预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。

2.混合试剂在25或者37(哺乳动物)水浴中预热30min

3.测定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL试剂四、800μL预热的混合试剂、100μL

上清液,迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值,分别记为A1A

2A测定管=A1A2

计算公式:

(1).按蛋白浓度计算

GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每mg蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶

活单位。

GSH-Px(nmol/min/mgprot)=[A测定管÷ε÷d×V反总×109Cpr×V样)÷T

=536×A测定管÷Cpr

(2).按样本质量计算

GSH-Px活力单位定义:一定温度中,每g样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活

单位。

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GSH-Px(nmol/min/g)=[A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V÷V样总)÷T

=536×A测定管÷W

3)按细胞数量计算

活性单位定义:一定温度中,每104个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px(nmol/min/104cell)=[A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V÷V样总)÷T

=536×A测定管÷细胞数量

4)按液体体积计算

活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GSH-Px(nmol/min/mL)=[A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷V÷T

=536×A测定管

εNADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cmV反总:反应体系总体积,1000μL=0.001L

1061mol=1×106μmolCpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V样:加入反应体系中上清液体

积,100μL=0.1mLV样总:加入提取液体积,1mLW,样本质量,gT:反应时间,3

min

注意事项:

1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;

2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;

3)测定过程操作须迅速;

4)细胞中GSH-Px活性测定时,细胞数目须在300-500万之间,细胞中GSH-Px的提

取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。

原创作者:青岛bob娱乐体育 生物科技有限公司

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